Onkologie, Hämatologie - Daten und Informationen
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6.3 Immunphänotypisierung

Autor/en: C.D. Baldus, E. Thiel
Letzte Änderung: 01.07.2008

Eine exakte und unverzügliche Diagnosestellung der akuten Leukämien ist wesentlich, um eine spezifische Therapie einleiten zu können. Hierbei besitzt die Immunphänotypisierung für die Diagnostik und Klassifikation einen wesentlichen Stellenwert und stellt neben der morphologischen Beurteilung sowie den zyto- und molekulargenetischen Analysen einen weiteren Mosaikstein dar. Die immunphänotypische Charakterisierung der Leukämien ist für die im Folgenden ausgeführten Aspekte von wesentlicher Bedeutung.

6.3.1 Indikationen

Indikationen zur Immunphänotypisierung sind:

  • Linienspezifizierung: Eine genaue Zuordnung der Leukämiezellen in B- und T-lymphatische sowie myeloische Zellreihen wie auch in die entsprechenden Reifungsgrade wird ermöglicht.
  • Subgruppeneinteilung: Unter Einbeziehung der Zyto- und Molekulargenetik können spezifische, biologisch und klinisch relevante Subgruppen charakterisiert werden.
  • Erkennung einer minimalen Resterkrankung (Minimal residual disease, MRD): Durch den Einsatz der Mehrfarbenimmunphänotypisierung ist ein MRD-Monitoring zum Nachweis von malignen Zellen mit aberranter Antigenexpression mit hoher Sensitivität möglich.
  • Therapieplanung: Durch die zunehmende Verfügbarkeit von monoklonalen Antikörpern für die Therapie von akuten Leukämien (z.B. Anti-CD33 bei akuter myeloischer Leukämie - AML - und Anti-CD20 bei akuter lymphatischer Leukämie der B-Linien - B-Linien-ALL) ist die Immunphänotypisierung zum Nachweis von potenziellen Zielantigenen hilfreich und erlaubt zudem vor und während der Therapie die Sicherstellung der Wirksamkeit einer spezifischen, antigengerichteten Behandlung.

6.3.2 Vorzüge

Zur Analyse des Immunphänotyps gilt die durchflusszytometrische Untersuchung (FACS) als Methode der Wahl, da sie schnell, präzise und in maschineller Weise eine umfassende Analyse des Oberflächenantigenprofils erlaubt. Hierbei ist nicht nur die Identifikation von leukämischen Subpopulationen, sondern zudem eine weitgehend untersucherunabhängige, standardisierte Quantifizierung in einem Arbeitsschritt gewährleistet. Unter Verwendung von spezifischen Antikörpern zum Nachweis von Differenzierungsantigenen (Cluster of differentiation, CD) können die unterschiedlichen Differenzierungsstufen der Myelopoese nachgewiesen werden.

Durch die Mehrfachfärbungen (es können bis zu 6 Antigene gleichzeitig auf ihre Expression hin untersucht werden) können zudem die Spezifität und die Sensitivität der Untersuchung deutlich gesteigert werden, sodass eine Evaluation der MRD mittels FACS im Rahmen von Verlaufsuntersuchungen während und nach erfolgter Therapie möglich ist.

6.3.3 Limitationen

Der Nachweis einer signifikanten Restblastenpopulation kann durch das Auftreten von gesunden hämatopoetischen Progenitorzellen im Rahmen der hämatopoetischen Rekonstitution nach erfolgter Chemotherapie oder Stammzelltransplantation erschwert werden - insbesondere dann, wenn keine aberrante Expression von spezifischen Zellantigenen bei der Erstdiagnosestellung als Referenz vorgelegen hat. Des Weiteren kann die Abgrenzung gegenüber einem fortgeschritten myelodysplastischen Syndrom (MDS) und einem in Transformation befindlichen myeloproliferativen Syndrom (MPS) durch die alleinige immunphänotypische Beurteilung meist nicht erbracht werden, sondern bedarf der Einbeziehung weiterer morphologischer und molekularer Befunde.

Mittels Immunphänotypisierung können eine Vielzahl von AML-Phänotypen charakterisiert werden, jedoch spielt die immunologische Subklassifikation der AML - im Gegensatz zur ALL - nur eine untergeordnete Rolle. Hingegen sind bei der AML zugrunde liegende genetische Aberrationen von wesentlicher Bedeutung und determinieren in erster Linie den morphologischen Phänotyp, anstatt mit einem spezifischen Antigenexpressionsmuster assoziiert zu sein. Die Immunphänotypisierung erlaubt die Unterscheidung von unreifen und reifen AML, von granulozytär, monozytär, erythrozytär und megakaryozytär differenzierten AML-Subtypen sowie der biphänotypischen akuten Leukämien (BAL nach EGIL, auch Bilineage-AL genannt; s. unten).

6.3.4 Methodik

Die Durchflusszytometrie erlaubt die Analyse der Antigenexpression auf Einzelzellebene. Hierbei ist die Erfassung von spezifischen Expressionsmustern membranständiger wie auch intrazellulärer Antigene gegeben. Eine Abgrenzung der leukämischen Zellpopulation gegenüber gesunden hämatopoetischen Zellen erfolgt auf dem Boden von qualitativen und quantitativen Expressionsunterschieden. Dabei zeichnen sich leukämische Blasten durch eine gesteigerte Expression von hämatopoetischen Progenitorzellantigenen sowie eine abgeschwächte Expression von reifen Differenzierungsantigenen aus. Zudem lässt sich eine aberrante Ko-Expression reifer und unreifer Marker häufig nachweisen. Des Weiteren ist bei einem Teil der AML-Patienten eine aberrante Expression lymphatischer Zellantigene (T- wie auch B-Linien-spezifisch) auf myeloischen Blasten nachweisbar. Diese phänotypischen Veränderungen sind wesentlich für die Abgrenzung gegenüber normalen hämatopoetischen Zellen.

Als Probenmaterial kommen Blutproben und Knochenmarkaspirate zur Anwendung, seltener andere Körperflüssigkeiten (Liquor, Aszites, Pleuraerguss). Es gibt zwei wesentliche Möglichkeiten der Zellisolierung: Lyse und Ficoll, wobei bei der Ficoll-basierten Aufreinigung eine Anreicherung von mononukleären Zellen mittels Dichtegradientenzentrifugation erfolgt. Pro Färbeansatz werden mehrere tausend Zellen (in der Regel 10 000) eingesetzt. Als genereller Konsens wird eine Antigenexpression als positiv gewertet, wenn mehr als 20% der Zellen eine im Vergleich zur Negativkontrolle (Isotypantikörper) positive Immunfluoreszenz aufweisen. Als Ausnahmen gelten Myeloperoxidase (MPO), CD3, CD1a, CD79a und terminale Desoxynucleotidyltransferase (TdT). Aufgrund der hohen Spezifität dieser Antigene wird für sie ein Cut-off-Level bei 10% (der Blasten) festgelegt. Darüber hinaus wird für TdT eine mikroskopische Verifikation der Expression gefordert.

6.3.5 Algorithmus zur Linienspezifizierung und Subgruppendifferenzierung

In einer Mehrstufenanalyse wird in einem ersten Schritt die Zuordnung zur T-, B- oder myeloischen Linie vorgenommen:

  • B-lymphatisch: CD19, cyCD22, CD79a
  • T-lymphatisch: cyCD3, CD2, CD7
  • myeloisch: MPO, CD13, CD33, CDw65
  • Progenitorzellantigene: CD34, TdT, HLA-DR, CD10, CD117

In einem zweitem Schritt folgt die genaue Subtypencharakterisierung:

  • cyIgM, kappa, lambda, CD20, CD24
  • CD1a, mCD3, CD4, CD5, CD8, TCR α/β, TCR γ/δ
  • CD14, CD15, CD41, CD61, CD64, Glykophorin A, CD71

Darüber hinaus besteht die Möglichkeit der Einstufenanalysen mit Antikörperpanels für AML und ALL oder mit Kombinationspanels. Das Konsensunspanel für die immunologische Diagnostik von akuten Leukämien des Kompetenznetzwerks Leukämien ist unter http://kompetenznetz-leukaemie.de aufgeführt.

6.3.6 Antigenexpression bei AML

Die immunphänotypische Zuordnung zur AML ist gegeben, wenn mindestens 2 der folgenden Marker auf Blasten nachweisbar sind: MPO, CD13, CD33, CDw65 und CD117, wobei MPO die höchste Spezifität für die myeloische Linie aufweist. Mindestens ein panmyeloischer Marker (CD13, CD33, CDw65) findet sich bei etwa 97% der AML Patienten, wobei jedoch nur bei ungefähr 55% aller Patienten alle 3 Antigene gleichzeitig nachgewiesen werden können.

Durch die zusätzliche Analyse der megakaryozytären (CD41, CD61) und erythropoetischen (CD71, Glykophorin A) Zellantigene sowie den zytoplasmatischen Nachweis von MPO können 100% der AML-Proben identifiziert und zugeordnet werden. Die gesteigerte Expression von hämatopoetischen Progenitorzellantigenen (CD34, CD117, HLA-DR) erlaubt die Abgrenzung gegenüber einer rein reaktiven, nach links verschobenen Myelopoese.

Expression lymphatischer Antigene

In etwa 24% der Fälle sind lymphatische Antigene nachweisbar. Es überwiegen T-Zell-Antigene (CD7-Expression bei 10-30% der AML, v. a. bei den Subtypen M0, M1 und M5a); nur in 3% der Fälle sind B-lymphatische Antigene (CD19) aberrant exprimiert.

Korrelation zwischen Immunphänotyp und FAB-Subtypen

Eine gute Korrelation zwischen Immunphänotyp und Morphologie entsprechend der FAB-Klassifikation (vgl. Kap. 2) ist lediglich für die 3 Subtypen M0, M6 und M7 gegeben. Auch wenn die AML M3 - im Gegensatz zu den übrigen AML-Subtypen -durch eine fehlende Expression von CD34 und HLA-DR charakterisiert ist, so ist dieses Expressionsmuster nicht ausschließlich bei der AML M3 zu finden (s. Tab. 6.5). Eine Korrelation zwischen Immunphänotypisierung und FAB-Klassifikation kann so nur als Musteranalyse versucht werden.

Tab. 6.5: Korrelation zwischen Antigenexpression, zytogenetischen Befunden und FAB-Subtypen [Schwartz S et al. 2003]
 FAB-Subtypen
AntigeneM0M1M2M3M4M4EoM5M6M7
Progenitorzellantigene
HLA-DR+++/--++++/-+/-
CD34++/-+/--+/-++/-+/-+/-
CD117++++/-+/-+-++
Panmyeloische Antigene
CD33+/-++/-+++++/-+/-
CD13+/-++++/-+++/-+/-+/-
CDw65+/-+++/-++++/-+/-
Myeloperoxidase (MPO)-+++++++-
Linienassoziierte myeloische Antigene
CD15--+-+++/-+/--
CD14----+++/---
CD11b----++---
Glykophorin A/CD36/CD71-------+/---
CD41/CD61--------+
Aberrante Antigene
 CD7,
TdT
TdTCD19,
CD56,
TdT
M3v:
CD2
CD2,
CD4,
CD7,
NG2*
CD4NG2*--
Zytogenetische Befunde
 --t(8;21)t(15;17)t(11q23)inv(16)t(11q23)-t(1;22)
* Die Expression von NG2 ist mit einer zugrunde liegenden MLL-t(11q23)-Translokation assoziiert.

6.3.7 Spezifische Leukämiesubgruppen

Biphänotypische akute Leukämie (BAL)

Die biphänotypische akute Leukämie (BAL) zeichnet sich durch eine synchrone ("hybride") Expression von myeloischen und lymphatischen Antigenen aus. Nur in sehr seltenen Fällen lassen sich voneinander unabhängige ("mixed") lymphoblastische sowie myeloblastische Zellklone nachweisen. Die Subgruppe der biphänotypischen Leukämie leitet sich von einer unreifen Leukämiestammzelle ab, die das Differenzierungspotenzial für die myeloische und die lymphatische Reihe besitzt. Eine Einordnung erfolgt nach den Kriterien der European Group of Immunological Classification of Leukemias (EGIL; s. Tab. 6.6) [Bene MC 1995]. Eine biphänotypische Leukämie liegt dann vor, wenn mehr als 2 Punkte für die myeloische und mehr als 2 für eine lymphatische Reihe erreicht werden. Es muss hier jedoch von der aberranten Expression myeloischer Antigene bei Subtypen der ALL unterschieden werden; diese treten häufig in Verbindung mit spezifischen Translokationen auf, z.B. t(12;21) oder t(9;22). Insgesamt ist die biphänotypische Leukämie selten und ihre klinische Bedeutung noch unklar.

Tab. 6.6: Klassifikation der biphänotypischen akuten Leukämie
PunkteB-lymphatische AntigeneT-lymphatische AntigeneMyeloische Antigene
2 CD79
CD22
cyIgM
cyCD3
TCR α/β
TCR γ/δ
Myeloperoxidase (MPO)

 
1 CD19
CD10
CD20
CD2
CD5
CD8
CD10
CD13
CD33
Cdw65
0,5 TdT
CD24
TdT
CD7
CD1a
CD14
CD15
CD64
CD117

Undifferenzierte Leukämie

Die Zellen der seltenen Subgruppe der undifferenzierten Leukämie exprimieren keinerlei linienspezifische Differenzierungsantigene, zeichnen sich jedoch durch eine Expression von CD34, HLA-DR, CD38 und CD7 aus.

AML/Natural-killer-cell-Leukämie

Diese Myeloid-/Natural-killer-cell-(Vorläufer-)Leukämie ist durch einen CD7+/CD56+/CD33+- oder CD13/CD34+/MPO-Phänotyp charakterisiert.

6.3.8 Nachweis einer minimalen Resterkrankung

In Studien konnte gezeigt werden, dass der Nachweis von residuellen Leukämiezellen (Minimal residual disease, MRD) während oder nach der Therapie von wesentlicher klinischer Relevanz ist und mit einer hohen Rezidivwahrscheinlichkeit korreliert [Kern W 2004]. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie unter Verwendung der 6-Farben-Technik kann eine Sensitivität von etwa 1:104 erreicht werden, welche für eine Bestimmung der MRD ausreichend sein kann. Die aberrante Expression von lymphatischen Markern und die gesteigerte Expression von frühen hämatopoetischen Progenitorzellantigenen bei der Erstdiagnosestellung sind zum MRD-Monitoring besonders gut geeignet. Eine durchflusszytometrische Analyse der MRD ist insbesondere dann von wesentlicher Relevanz, wenn aufgrund fehlender genetischer Veränderungen keine molekulargenetische MRD-Bestimmung möglich ist.

Als limitierender Faktor bleibt jedoch die eingeschränkte Sensitivität der durchflusszytometrisch basierten MRD-Analyse hervorzuheben. Lediglich mit der zurzeit noch nicht routinemäßig eingesetzten 6-Farben-Technik lässt sich eine ausreichend Sensitivität von 1:104 erreichen. Des Weiteren ist ein aberranter Immunphänotyp zwar bei dem überwiegenden Anteil von AML-Patienten nachweisbar, jedoch erscheint eine zuverlässige MRD-Bestimmung mit Detektion spezifischer Antigenexpressionsmuster nur bei einem Teil der Patienten (75-85%) möglich. Zudem ist zu beachten, dass sich der Immunphänotyp im Verlauf der Erkrankung ändern kann, wobei ein unterschiedliches Antigenexpressionsmuster zum Zeitpunkt der Erstdiagnosestellung und bei Eintreten des Rezidivss nachweisbar ist.

6.3.9 Immunphänotyp und prognostische Relevanz

Die prognostische Relevanz der Expression einzelner Antigene wurde in verschiedenen Studien untersucht (v.a. CD56 und CD34). Dennoch konnte kein eindeutiger Konsens über die Relevanz spezifischer Marker als prognostisch unabhängige Variablen aufgestellt werden. Es ließ sich jedoch zeigen, dass die gleichzeitige Expression von 5 myeloischen Markern mit einer guten Prognose assoziiert ist, und der Nachwies dieses reifen Immunphänotyps stellt einen prognostisch unabhängigen Faktor dar. Die Patienten zeichnen sich zudem häufig durch ein jüngeres Alter, eine geringere P-Glykoprotein-Aktivität und eine verminderte In-vitro-Resistenz aus.

6.3.10 Zusammenfassung

Die Immunphänotypisierung gewährleistet eine sensitive und spezifische Sofortdiagnostik für den Nachweis und die Differenzierung akuter Leukämien. Sie stellt eine unverzichtbare Ergänzung zur morphologischen Diagnostik dar und ist für die korrekte Diagnosestellung wegweisend. Zudem erlauben die kontinuierliche Charakterisierung neuer Antigene, die technischen Weiterentwicklungen und der hohe Standardisierungsgrad der Durchflusszytometrie die Implementierung der Immunphänotypisierung in neue Therapiekonzepte. Die Anwendung zum Monitoring der MRD und der zunehmende Einsatz von gerichteten Antikörpertherapien erweitern den Stellenwert der Immunphänotypisierung in den prognostischen und therapeutischen Bereich hinein.

Literaturreferenzen:

  • Bene MC et al.
    Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL).
    Leukemia 1995;9:1783-1786


  • Kern W et al.
    Determination of relapse risk based on assessment of minimal residual disease during complete remission by multiparameter flow cytometry in unselected patients with acute myeloid leukemia.
    Blood 2004;104:3078-3085


  • Schwartz S et al.
    Expression of the human homologue of rat NG2 in adult acute lymphoblastic leukemia: close association with MLL rearrangement and a CD10(-)/CD24(-)/CD65s(+)/CD15(+) B-cell phenotype.
    Leukemia 2003;17:1589-1595


Bei ONKODIN publiziert in Kooperation mit "Deutscher Ärzte-Verlag" (Publikation als Buch)
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