 |
3.7 Molekulare Marker des malignen Melanoms
Die Suche nach molekularen Markern ist durch die neuen Methoden der Molekularbiologie und Proteomik intensiviert worden. Die feingewebliche Untersuchung von Melanomen und melanomverdächtigen Läsionen sowie die gängigen Staging-Untersuchungen basieren auf der traditionellen mikroskopischen Diagnostik. In den letzten Jahren haben sich zahlreiche molekulare, experimentelle Verfahren etabliert, die im Folgenden dargestellt werden.
3.7.1 Genexpressionsprofile (DNA-Chiptechnik)
Die ersten Arbeiten über das Genexpressionsprofil des menschlichen kutanen Melanoms wurden von der Arbeitsgruppe von Bittner et al. publiziert [Bittner M 2000]. Bei der Chiptechnik werden auf Objektträgern immobilisierte Oligonukleotide von bis zu 22.000 Genen mit patienteneigener, in DNA umgeschriebener RNA (z.B. aus Tumoren) hybridisiert. Aufgrund der während der Umschreibung von RNA in DNA eingebauten Farbstoffe lassen sich Gene mit einer Referenzprobe (z.B. Normalgewebe) als hochreguliert, unverändert oder herunterreguliert charakterisieren. Mittels komplizierter Computeralgorithmen wird eine sog. hierarchische Clusteranalyse durchgeführt, um Expressionsprofile oder molekulare Signaturen zu definieren. Mittels dieser Technik gelang es erstmals, das Expressionsmuster von Tausenden von Genen simultan darzustellen, was den Grundstein für eine molekulare Taxonomie der Krebserkrankung sowie die Identifizierung neuer Gene (z.B. für das kutane Melanom) legte. So war in der oben zitierten Diskriminationsanalyse das WNT5A-Gen mit einer gesteigerten Motilität und Invasivität der Melanomzellen assoziiert [Weeraratna AT 2002]. Daneben war das Rho C-Gen in gleicher Weise an der Motilität und Invasivität beteiligt [Clark EA 2000]. Darüber hinaus wurde das MITF-Gen als melanomspezifischer Trigger identifiziert, der den anti-apoptotischen Faktor Bcl-2 hochreguliert [King R 1999] [McGill GG 2002].
Ein wesentlicher Schritt im Verständnis der molekularen Pathogenese des Melanoms wurde auch durch die Arbeiten von Davies et al. geleistet [Davies H 2002], der zeigen konnte, dass eine Aktivierung der Mutation des B-Raf-Gens beim Melanom vorliegt, was den Ras-Raf-MEK-ERK-Signalweg konstitutiv aktiviert.
Ziel unserer Arbeitsgruppe ist es, mittels der Chiptechnik die mikroskopisch dominierte Klassifikation des malignen Melanoms um eine molekulare Klassifikation zu ergänzen [Nambiar S 2005]. Eine Vielzahl von Expressionsprofilen (z.B. des Melanoms) erlaubt zusammen mit den klinischen Daten zum Verlauf und zur Metastasierung eine Abschätzung des malignen Verhaltens des Tumors. Auf diese Weise lassen sich Profile definieren, die mit einem erhöhten oder reduzierten Metastasierungsrisiko einhergehen oder Aussagen über die Prognose treffen.
Polymorphismen für Gene mit Regulatorfunktion bei der Immunantwort und bei Kontrollvorgängen des Wachstums können für die individuelle Neigung zur Entwicklung einer Tumorerkrankung oder für deren Prognose verantwortlich sein. Verschiedene Nukleotidpolymorphismen (SNP) pro- und antiinflammatorischer Zytokine bzw. Wachstumsfaktoren (z.B. IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, Interferon-γ und TGF-β) wurden an 169 Patienten mit kutanem malignen Melanom neben 261 Kontrollen untersucht [Howell WM 2003]. Hierbei fanden sich keine SNP-Genotypen oder Allele, die mit der Melanomsuszeptibilität vergesellschaftet waren.
Eine vor kurzem publizierte Studie von SNP-Arrayuntersuchungen führte zur Identifizierung des Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktors (MITF), der im Melanom amplifiziert vorlag [Garraway LA 2005]. Die MITF-Amplifizierung fand sich häufiger bei metastatischer Melanomerkrankung und korrelierte mit reduziertem Überleben. Die ektope MITF-Expression zusammen mit der B-Raf-(V600E)-Mutation war imstande, primäre humane Melanozyten zu transformieren, wodurch MITF als Melanom-Onkogen identifiziert wurde [Garraway LA 2005]. Dementsprechend stellen Strategien gegen MITF in Kombination mit B-Raf mögliche zukünftige molekulare Therapien des malignen Melanoms dar.
Mittels Array-Hybridisierungen wurden viele neue interessante Gene identifiziert, die in der Pathophysiologie des Melanoms eine Rolle spielen. Die Bestätigung und Analyse der biologischen Relevanz und der klinischen Nützlichkeit der identifizierten Gene sind Aspekte der translationellen Medizin und werden wahrscheinlich Eingang in die Diagnostik der Patienten mit malignem Melanom haben.
3.7.2 Sentinel-Lymphknoten-RT-PCR
Eine Vielzahl weiterer molekularer Verfahren wurde etabliert, die bestimmte Aspekte des Melanoms analysieren. So wurden z.B. in unbefallenen Sentinel-Lymphknoten quantitative real-time Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionen (RT-PCR) durchgeführt, die verschiedene Melanommarker in den unbefallenen Lymphknoten zu einem Zeitpunkt nachweisen konnten, wo immunhistologisch noch keine Detektion möglich war (Stadium der Mikrometastasierung) [Takeuchi H 2004b]. Interessant in dieser Studie war die Tatsache, dass eine RNA-Extraktion aus Formalin-fixiertem Paraffinmaterial möglich war und - je nach Marker - eine exzellente Korrelation mit Gefriergewebe vorhanden war [Takeuchi H 2004b]. Dieses ist u.a. deshalb bemerkenswert, weil in vielen Labors, einschließlich desjenigen der Autoren, eine verlässliche Extraktion von RNA aus Formalin-fixiertem Material bislang nicht möglich ist. In der vorliegenden Studie wurden von Takeuchi et al. β1-4-N-Acetylgalactosaminyl-Transferase (GalNAc-T) und Paired-box homeotic gene transcription factor 3 (Pax3), Melanom antigen recognized by T cells-1 (MART-1) und Melanoma antigen gene-A3 family (MAGE-A3) eingesetzt. 30% der in der Immunhistochemie negativen Sentinel-Lymphknoten zeigten zumindest die Expression eines der vier Marker in der RT-PCR. Der Nachweis mindestens eines solchen Markers war hoch signifikant mit Rezidivneigung (p<0,0001) und dem Gesamtüberleben (p=0,0002) assoziiert [Takeuchi H 2004b]. Pax3 ist ein embryonaler Transkriptionsfaktor in neuroektodermalen Zellen, der eine Rolle in der Migration fetalen Gewebes spielt [Maschhoff KL 2000]. GalNAc-T ist eine Glykosyltransferase, das die Oberflächenganglioside GM2 und GD2 auf Tumorzellen glykosiliert, die bei fortgeschrittenem Melanom gefunden werden [Kuo CT 1998]. MART-1 und MAGE-A3 stellen immunogene Melanom-assoziierte Proteine dar.
Auch eine frühere Studie aus derselben Arbeitsgruppe konnte aus Paraffin-eingebetteten, unbefallenen Sentinel-Lymphknoten mittels einer Multimarker-RT-PCR für Tyrosinase, MART-1, Tyrosinase-related protein-1 und Tyrosinase-related protein-2 den Stellenwert der Tyrosinase und MART-1-Transkriptanalyse dokumentieren [Kuo CT 2003]. Die Analyse der molekularen Risikofaktoren in histopathologisch negativen Sentinel-Lymphknoten waren in dieser Studie geeignet, Frühstadien der Melanomerkrankung zu identifizieren, die mit einer schlechten Prognose einhergehen.
Eine weitere Arbeit untersuchte die Detektion von okkulten Melanomzellen in Sentinel-Lymphknoten mittels quantitativer RTPCR an 139 Patienten [Giese T 2005]. Die RT-PCR wurde für die Melanommarker Melan-A und Tyrosinase durchgeführt. 23 Patienten (17%) waren histopathologisch und mittels RT-PCR positiv auf einen oder beide Marker. 31 Patienten (28%) ohne histopathologische Anzeichen eines befallenen Sentinel-Lymphknoten zeigten einen positiven Nachweis eines oder beider Marker in der quantitativen RT-PCR. Innerhalb eines medianen Follow-up von 29 Monaten trat bei 8 Patienten (35%) mit histopathologisch befallenen Sentinel-Lymphknoten, bei 4 (10%) mit submikroskopischen, mittels RT-PCR diagnostizierten Tumorzellen und bei keinem der in beiden Techniken negativen Patienten ein Tumorrezidiv auf [Giese T 2005]. Letztendlich wäre eine solche Möglichkeit des molekularen Upstagings von in der Immunhistochemie negativen Sentinel-Lymphknoten mittels quantitativer RT-PCR eine Methode mit hoher diagnostischer und ggf. prognostischer Relevanz. Auf diese Weise könnte nach erfolgter Operation der Nutzen aus dem erhaltenen Operationsmaterial für den Patienten vergrößert werden.
In befallenen Sentinel-Lymphknoten wurde mittels quantitativer RT-PCR eine Erhöhung der mRNA für IL-10 und Interferon-γ festgestellt [Lee JH 2005], von denen bekannt ist, dass sie in dendritischen Zellen das immunsuppressive und toleranzinduzierende Enzym Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) induzieren. Die IDO-Konzentration war in Sentinel-Lymphknoten signifikant höher als in umgebenden, Nicht-Schildwächterlymphknoten. Diese Arbeit zeigt, dass schon bei Patienten im AJCC-Stadium I/II das Primärmelanom immunsuppressive Wirkung auf den Sentinel-Lymphknoten entfaltet. Keine signifikanten Differenzen fanden sich für Interleukin-2 und Interleukin-10 im Schildwächterlymphknoten und den anderen Lymphknoten des gleichen Abstromgebiets [Lee JH 2005].
3.7.3 Zirkulierende Melanommarker
Die Aussagekraft der Tyrosinase-mRNA im peripheren Blut wurde bei Melanompatienten im Stadium II und III mittels RT-PCR bestimmt [Voit C 2005]. Patienten im Stadium II und III, die zu allen Untersuchungszeitpunkten (Blutentnahme alle 6 Monate für Tumordicke =/<1,5 mm und alle 3 Monate für Tumordicke >1,5 mm und Stadium III-Patienten) negativ für Tyrosinase-Transkripte im peripheren Blut waren, hatten eine 97%ige Chance eines 6 Jahre erkrankungsfreien Überlebens verglichen mit 67% der Patienten, die mindestens einmal in dieser Untersuchung ein positives Ergebnis aufwiesen. Das relative Risiko für Tod durch das Melanom betrug 12,6 (p<0,01) [Voit C 2005].
Ähnliche Daten wurden von einer anderen Gruppe an 322 Patienten erhoben, wobei die RT-PCR am Lymphknoten selbst durchgeführt wurde [Ulrich J 2004]. Hierbei fand sich bei 39 von 288 negativen Sentinel-Lymphknoten nachweisbare Tyrosinase-mRNA. Bei ähnlichem Studiendesign kamen US-amerikanische Untersucher jedoch zu einem anderen Ergebnis [Kammula US 2004]. Diese Arbeitsgruppe fand, dass bei einem längeren Follow-up von 67 Monaten Patienten mit histologisch negativen Sentinel-Lymphknoten und positiver Tyrosinase RT-PCR kein größeres Rezidivrisiko besaßen als Patienten mit RT-PCR-negativen Lymphknoten [Kammula US 2004]. Frühere Studien ergaben eine Korrelation des klinischen Stadiums und der Tumorprogression mit der Anwesenheit zirkulierender Melanom-assoziierter Antigene (Tyrosinase, MUC18 und Melan-A/MART-1) [Palmieri G 1999], während neuere Studien die prognostische Bedeutung nicht nachweisen konnten [Ranieri JM 2005] [Takeuchi H 2003].
3.7.4 Immunhistochemie
Auch die konventionelle Immunhistochemie kann wertvolle Hinweise auf den Verlauf der Melanomerkrankung liefern. Zum Beispiel wurde der aktivierende Transkriptionsfaktor-2 (ATF-2) in primären Melanomschnitten immunhistochemisch im Zytoplasma und im Zellkern lokalisiert [Berger AJ 2003]. Starke zytoplasmatische ATF-2-Expression in Primärtumoren war mit besserem Überleben assoziiert, während nukleäre ATF-2-Expression mit Metastasierung und limitiertem Überleben hochsignifikant vergesellschaftet waren [Berger AJ 2003].
Eine immunhistochemische Untersuchung des CXCR4-Rezeptors wurde an 71 Tumorproben des primären kutanen Melanoms (Breslowdicke >1 mm) durchgeführt [Scala S 2005]. Der CXCR4-Rezeptor ist ein Transmembran-Zytokin-Rezeptor, der vorwiegend auf Lymphozyten exprimiert und für die Chemotaxis wichtig ist. Sein Ligand CXCL12 fördert die Invasion durch Aktivierung der Typ-I-membrangebundenen Matrixmetalloproteinasen und von kleinen GTPase-Proteinen (z.B. RhoA, Rac1 und CDC42) [Murphy PM 2001] [Robledo MM 2001]. Bei 31 von 71 (43,6%) der primär kutanen Melanome fand sich eine Expression des CXCR4-Rezeptors. Im Follow-up von 38 Monaten ging die CXCR4-Expression auf Tumorzellen mit einer schlechteren Prognose für das mediane krankheitsfreie Intervall (22 Monate) und das Überleben (35 Monate) einher. In der Multivarianzanalyse waren die CXCR4-Expression, das Vorhandensein einer Ulzeration und ein positiver Sentinel-Lymphknotenstatus unabhängige prognostische Faktoren [Scala S 2005]. Ähnliche Bedeutung besitzt der Chemokin-Rezeptor 7 (CCR7) auf Melanomzellen, der durch das CCL21-Chemokin reguliert wird [Takeuchi H 2004a].
Protein-Microarrays, die immobilisierte Antikörper gegen bekannte Zellzyklusproteine, Apoptosemarker, Melanom-Antigene, Transkriptionsfaktoren, DNA-mismatch repair proteine usw. enthalten, wurden mit 165 Melanomproben zur Reaktion gebracht [Alonso SR 2004]. Hierbei fand sich das Zellzyklusprotein Cyclin D1 bei horizontal wachsenden Melanomen in 48%, während es bei vertikalem Wachstumsmuster nur in 14% nachweisbar war. Das Zellzyklusprotein p16INK4a war bei 89% der vertikal wachsenden Melanome bzw. bei 71% der metastatischen Erkrankungen vermindert exprimiert. Die Studie konnte eine Kombination biologischer Marker identifizieren, die mit einem verkürzten Überleben bei Patienten mit vertikalem Melanom einhergingen. Hierzu gehörten Ki67 als Proliferationsmarker, p16INK4a, p21CIP1 und Bcl-6 [Alonso SR 2004], wobei p16INK4a und p21CIP1 Zellzyklusmarker darstellen.
3.7.5 Proteomik
Neben der Analyse des Expressionslevels (RNA) entwickelte sich die funktionelle Proteomik als eine wichtige und relevante Methode in der Forschung, mit der sich die Proteinexpression und vor allem posttranslationale Modifikationen analysieren lassen. Bislang existieren nur wenige Studien, bei denen Melanomzelllinien mit Melanozyten mittels zweidimensionaler Elektrophorese und Massenspektrometrie verglichen wurden [Bernard K 2003] [Carta F 2005]. Mittels dieser Analyse können nicht nur verschiedene Isoformen der synthetisierten Proteine, sondern auch deren posttranslationale Modifikation (z.B. Phosphorylierung) untersucht werden. Für die Aktivität von Signalwegen in Proteinkaskaden ist meistens das phosphorylierte Protein aktiv. Die Aktivierung solcher Proteine lässt sich mittels RNAbasierten Oligonukleotid-Arrays nicht feststellen. Weiterhin wurden differenziell exprimierte Proteine von Patienten mit Melanomen im Stadium AJCC I und II mit bzw. ohne lokoregionäre Metastasen mittels der neuen Technik der oberflächenverstärkten Laserdesorption/-ionisation(SELDI)-Massenspektrometrie identifiziert, die ein späteres Rezidiv der Melanomerkrankung voraussagten [Wilson LL 2004].
3.7.6 DNA-Methylierungsanalyse
Vor einigen Jahren wurde die Hypermethylierung von Promotorsequenzen im Bereich der CpG-Inseln als mögliche epigenetische Regulation der Expression von Tumorsuppressorgenen (TSG) identifiziert [Baylin SB 2000]. Die Detektion von hypermethylierten Genen bei verschiedenen Tumorarten hat beachtliche Bedeutung erlangt, da diese Veränderungen zur Malignität beitragen können. Neben Deletion und Mutation von Tumorsuppressorgenen stellt die epigenetische Inaktivierung einen Mechanismus der Tumorpromotion und -progression dar. Für eine Reihe verschiedener Tumorarten wurde ein epigenetisches Tumorprofil bereits publiziert [Widschwendtner M 2002]. Für das maligne Melanom wurde eine Methylierung des RAS-assoziierten Domäneproteins 1A (RASSF1A) [Spugnardi M 2003], für den Retinsäure-Rezeptor β2 (RAR-β2) und für die O6-Methylguanin-DNA-Methylatransferase (MGMT) beschrieben [Hoon DS 2004]. Während die Funktion der Tumorsuppressoren im Einzelnen noch weitgehend unbekannt ist, findet sich bei metastatischen Tumoren eine zunehmende Methylierung verschiedener Proteine.
Kürzlich wurde die zellfreie DNA im Serum von Melanompatienten sowohl hinsichtlich spezifischer Mikrosatelliten mit Verlust der Heterozygosität (LOH) auf verschiedenen Chromosomen [Fujiwara Y 1999] als auch mit Blick auf die Methylierung untersucht [Furuta J 2004] [Hoon DS 2004] [Marini A 2006]. Von diesen Untersuchungen lassen sich in Zukunft neue, aus dem Blut zu bestimmende Markerkombinationen zum Monitoring der Melanomerkrankung erwarten. Insbesondere werden von der positionellen Methylierungsanalyse wesentliche Aussagen zur Unterscheidung von dysplastischem (atypischem) Nävuszellnävus und malignem Melanom erwartet.
|
|
Bei ONKODIN publiziert in Kooperation mit "Deutscher Ärzte-Verlag"; Publikation als Buch:
[ Mehr]
Aktuelle Berichte vom 58th
ASH Annual Meeting 2016,
San Diego, Kalifornien, USA [ Mehr]
2016 ASCO Annual Meeting - aktuelle Berichte. Dieser Service wird gefördert durch:
[ Mehr] |
Bildatlas Hämatologie
Druckversion
ISSN: 2193-6021
Zum Seitenanfang