Onkologie, Hämatologie - Daten und Informationen
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4.9 Experimentelle Antiangiogenesetherapie

Autor/en: C.D. Mnich, R. Dummer
Letzte Änderung: 01.12.2006

4.9.1 Einleitung

Angiogenese ist ein essenzieller Prozess in der Progression solider Tumoren. Beim Melanom ist auch die Lymphangiognese von Bedeutung sowie die Bildung von gefäßähnlichen, intratumoralen Mikrokanälen, sog. vaskulogene Mimikry [Maniotis AJ 1999]. Dieses Kapitel geht vor allem auf die Hämangiogenese ein. Angiogenese begünstigt die Metastasierung und ist eine unbedingte Voraussetzung für lokales Tumorwachstum, da solide Tumoren bereits bei einem Tumordurchmesser von 1-2 mm neue Blutgefäße zur Sicherung ihres O2-Bedarfs benötigen. Die Entdeckung, dass sich neue Gefäße um solide Tumoren herum bilden, wurde bereits 1907 von Goldmann beschrieben. 1971 postulierte Folkman, dass Tumorwachstum und Metastasierung angiogeneseabhängig seien und dass sich beides mit antiangiogenetischen Strategien entsprechend blockieren ließe. Dies war der Beginn einer bis heute andauernden intensiven Erforschung des komplexen physiologischen Gleichgewichts zwischen pro- und antiangiogenetischen Faktoren (s. Tab. 4.12) sowie der Entwicklung einer großen Anzahl von Antiangiogenesepräparaten, auf die im Folgenden näher eingegangen werden soll. Die Berührungspunkte zur Chemotherapie nehmen zu, da einige Chemotherapeutika, z.B. Temozolomid (Temodal), zusätzlich potente antiangiogenetische Wirkungen zeigen [Kurzen H 2003] und da Antiangiogenesepräparate mehr und mehr in Kombination mit Chemotherapeutika zum Einsatz kommen.

Die melanomrelevanten antiangiogenetischen Substanzen lassen sich in vier Hauptgruppen einteilen:

Substanzen, die direkt auf Endothelzellen einwirken:
  • TNP-470
  • Antikörper gegen das αvβ3-Integrin
  • Endostatin
  • Angiostatin
Substanzen, die Angiogenesefaktoren blockieren:
  • Monoklonale VEGF-Antikörper
  • Synthetische VEGF-Rezeptor-Inhibitoren
  • Ribozyme gegen VEGFR-mRNA
  • DNA-Vakzine gegen VEGFR-2
  • Carboxyamidotriazol
  • Plättchenfaktor-4
Inhibitoren der Matrix-Metalloproteinasen (MMPs):
  • Natürlich existierende MMP-Inhibitoren
  • Synthetische MMP-Inhibitoren
Substanzen mit multiplen/unbekannten Wirkungsmechanismen:
  • Thalidomid
  • Suramin
  • IL-12
  • Thrombospondin-1 (TSP-1)
  • Interferon-α (IFN-α)
Tab. 4.12: Partielle Liste pro- und antiangiogenetischer Faktoren
Proangiogenetische FaktorenFunktion
αvβ3-IntegrinVermittlung von Interaktionen zwischen Zelle und extrazellulärer Matrix
Ang-1 und Tie-2Gefäßstabilisierung, Inhibition der Permeabilität
AngiogeninAktivierung von Endothelzellen über Stimulation der Zytokinausschüttung
bFGF, HGF, MCP-1Stimulation der Angio-/Arteriogenese
IL-1α und TNF-αInduktion von CXC ELR+ Chemokinen
NOS/COX-2Stimulation von Angiogenese und Vasodilatation
PAI-1Stabilisierung neu gebildeter Gefäße
PD-ECGFChemotaktisch für EC und Monozyten und selektiv wachstumsfördernd für EC
Plasminogenaktivatoren/ MMPsECM-Remodellierung, Freisetzung und Aktivierung von Wachstumsfaktoren
PlGFAngiogenesestimulation über Bindung an VEGFR-1, kompetitiv zu 165 kD VEGF
TGF-β1, Endoglin, TGF-β RezeptorenStimulation der ECM- Produktion, vielfältige Wirkungen
ThrombinHeraufregulation von VEGF-Rezeptoren, αvβ3-Integrin und MMP-9
TNF-αInduktion von Angiogenin, potenter Angiogenesepromotor in vivo 
TSP-1Inhibition von Endothelzellwachstum, Migration, Röhrenbildung und Induktion von Apoptose.
VEGF-Familie, Flt-1, Flk-1Stimulation von Angiogenese, Permeabilität, Leukozytenadhäsion
Antiangiogenetische FaktorenFunktion
Ang-2Antagonist zu Ang-1
AngiostatinAntagonist zu Angiogenin, unterdrückt Tumorangiogenese, u.a. via Angiomotin
EndostatinInhibition von EC-Migration und -Überleben
IFN-α, -β, -γ, IP-10, IL-4, IL-12, IL-18Inhibition der EC-Migration, Herabregulierung von bFGF
PF-4Inhibition von VEGF und bFGF
Prolaktin (16-kDa Fragment)Inhibition von bFGF/VEGF
TGF-βEndothelzellinhibition, unter best. Bedingungen Inhibition der Angiogenese
TIMPsInhibition von MMP
TNF-αInhibition des EC-Wachstums in vitro 
TSP-1, -2Inhibition der perizellulären Proteolyse, Inhibition von EC-Migration, -Wachstum, -Adhäsion und -Überleben
Vasostatin; CalreticulinInhibition von EC-Wachstum
Ang-1/Ang-2 Angiopoietin-1 und -2; bFGF Basic fibroblast growth factor; EC Endothelzelle; ECM Extrazelluläre Matrix; HGF Hepatocyte growth factor; IFN Interferon; IL Interleukin; IP Inducible protein; MCP-1 Monocyte chemoattractant protein-1; MMP Matrix metalloproteinase; MMPI Matrix metalloproteinase inhibitor; PAI-1 Plasminogen activator inhibitor-1; PD-ECGF Platelet-derived endothelial cell growth factor; PF-4 Platelet factor-4; PlGf Placental growth factor; TGF-α,TGF-β Transforming growth factors alpha and beta; TIMP Tissue inhibitor of metalloproteinases; TNF Tumor necrosis factor; TSP-1 Thrombospondin-1; VEGF Vascular endothelial growth factor; VEGFR-1 VEGF-receptor-1 (= Flt-1); VEGFR-2 VEGF-receptor-2 (= Flk-1)

4.9.2 Substanzen, die direkt auf Endothelzellen wirken

TNP-470

TNP-470 ist ein wirksameres und weniger toxisches Analogon von Fumagillin, einer angiostatischen, von Aspergillus fumigatus fresenius produzierten Substanz. Zu den vermuteten Wirkungsmechanismen von TNP-470 zählt die kompetitive Bindung an bFGFRezeptoren mit niedriger Affinität, die für NIH/3T3-Fibroblasten nachgewiesen werden konnte [Bond SJ 2000]. So konnte die durch bFGF induzierte Proliferation der Endothelzellen mit TNP-470 gehemmt werden. Des Weiteren ist für Fumagillin bekannt, dass es die Neovaskularisierung durch Arretierung des Endothelzellzyklus in der späten G1-Phase inhibiert. TNP-470 zeigt antineoplastische Effekte in vitro und in vivo. Für verschiedenste solide Tumoren konnte eine Wachstumsinhibition von Tumorxenotransplantaten in Ratten und Mäusen nachgewiesen werden [Zogakis TG 2001]. TNP-470 hemmte sowohl Tumorzellwachstum in vitro als auch das Wachstum der Tumorgefäße in vivo [Zogakis TG 2001]. Auch das Metastasenwachstum unterschiedlicher Tumoren konnte in Tierversuchen vielfach inhibiert werden [Zogakis TG 2001].

In klinischen Phase-I-Versuchen zeigte TNP-470 eine rasche Pharmakokinetik mit einer Halbwertszeit von ca. 1 h und eine gute Toleranz bei einer wöchentlichen Maximaldosis von 3x 60 mg/m2 i.v. [Zogakis TG 2001]. In einer anderen Phase-I-Studie wurden 25-235 mg/m2 1x/Woche als 4h-Infusion verabreicht. Bei den teilnehmenden 38 Patienten mit verschiedenen fortgeschrittenen Tumoren konnte in keinem Fall eine objektive Verbesserung beobachtet werden, jedoch hatte ein Melanompatient einen stabilen Krankheitsverlauf über 27 Wochen [Bhargava P 1999]. Dosislimitierend war in beiden Studien die zerebelläre Toxizität. Bei Patienten mit AIDS-assoziiertem Kaposi-Sarkom, die mit verschiedenen Dosen von TNP-470 behandelt worden waren, zeigten 18% der Patienten ein partielles Ansprechen [Dezube DJ 1998]. Bei Patienten mit fortgeschrittenen Zervixkarzinomen kam es in einem von 18 Fällen zu einem kompletten Ansprechen und in drei Fällen zu einer partiellen Besserung des Befunds. Bei Patienten mit metastasierendem Nierenzellkarzinom zeigten ein Patient von 20 ein teilweises Ansprechen und 6 Patienten einen stabilen Krankheitsverlauf über mindestens 6 Monate [Stadler WM 1999].

Antikörper gegen das αvβ3-Integrin

Die Integrinfamilie der Zelladhäsionsrezeptoren vermittelt Interaktionen zwischen Zelle und extrazellulärer Matrix. Endothelzellen exprimieren das αvβ3-Integrin (Vitronektinrezeptor). Bindet ein Ligand an diesen Rezeptor, werden intrazelluläre kalziumabhängige Signale in Gang gesetzt, welche die Zellmotilität beeinflussen. Die Expression von αvβ3 korreliert mit der vertikalen Wachstumsphase von experimentellen Melanomen [Buerkle MA 2002]. In vitro zeigte sich, dass ein Antikörper gegen αvβ3 Angiogenese inhibieren kann, die sowohl durch bFGF als auch durch TNF-α in chorioallantoidalen Membranen aus Hühnerembryonen (CAM-Assay) induziert worden ist. Die Neovaskularisierung humaner Melanomzellen in einem CAM-Assay wurde durch LM-609, einem murinen monoklonalen Antikörper gegen αvβ3, gehemmt. Auch das Tumorwachstum konnte durch LM-609 im humanen Melanom, Bronchial-, Pankreas- und Larynxkarzinom in einem CAM-Assay verhindert werden, wobei auch Apoptose in den proliferativen Blutgefäßzellen dieser Tumoren induziert werden konnte. Intravenös verabreichtes LM-609 zeigte auch in vivo im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikante Wachstumshemmung und Verringerung der Mikrogefäßanzahl von αvβ3-negativen, in Vollhaut auf SCID-Mäuse transplantierten Brustkrebszellen. Auch Mitjans et al. bestätigten, dass durch gegen das Integrin αvβ3 gerichtete Antikörper das experimentelle Melanomwachstum in vitro und in vivo inhibiert werden kann [Mitjans F 2000]. Vitaxin ist die humanisierte Form des murinen LM-609-Antikörpers. In einer Phase-I-Studie, bei der 14 Patienten mit soliden Tumoren pro Woche sechs 90-minütige Vitaxin-Infusionen mit ansteigenden Dosen von 0,1-4,0 mg/kg/Woche verabreicht wurden, zeigten sieben Patienten einen stabilen Krankheitsverlauf; da es bei einem Patienten mit fortgeschrittenem Leiomyosarkom zu einer teilweisen Besserung des Krankheitszustands gekommen war, wurde eine sechsmonatige Phase-I/II-Studie an Patienten mit fortgeschrittenen Leiomyosarkomen durchgeführt, bei der sich jedoch kein objektiver Therapieerfolg einstellte [Patel SR 2001]. Auch in einer Vitaxin-Pilotstudie an 9 Patienten mit verschiedenen metastasierenden Tumoren zeigte sich kein Therapieerfolg [Posey JA 2001].

Endostatin

Das 20 kD-Protein Endostatin ist ein C-terminales Spaltprodukt von Kollagen XVIII. Der genaue antiangiogenetische Mechanismus ist nicht bekannt. Endostatin kann den Zellzyklus von Endothelzellen in der G1-Phase arretieren [Dhanabal M 1999] und induziert Apoptose in Endothelzellen, nicht aber in Fibroblasten oder glatten Muskelzellen [Parker V 2000]. Ein anderer Wirkungsmechanismus ist die Induktion der proteolytischen Aktivierung von MMP-2 und der katalytischen Aktivität von Membran-Typ-1-MMP (MT1-MMP und MMP-2) [Kim YM 2000]. Endostatin hemmt in vitro das Wachstum bFGF-stimulierter, boviner Kapillarendothelzellen, nicht jedoch dasjenige glatter Muskelzellen, Fibroblasten, Lewis-Bronchialkarzinomzellen, Epithelzellen und boviner Retina-Pigmentepithelzellen. In einem CAM-Assay inhibierte rekombinantes murines Endostatin die Angiogenese in vivo.

Die Antitumoraktivität von rekombinantem Endostatin im Sinne einer Wachstumsinhibition wurde nach s.c. Injektion in Mäusen für das B16-F10-Melanom und andere Tumoren nachgewiesen [Kim YM 2000]. Das Tumorwachstum von murinen Adenokarzinomen konnte in vivo durch Injektion von rekombinanten Adenoviren, welche das Endostatingen exprimierten, inhibiert werden [Feldman AL 2000].

In klinischen Versuchen wurde ein rekombinantes, vom Hefepilz produziertes, humanes Endostatin (rh-Endostatin) eingesetzt, das ähnliche antiangiogenetische und antitumoröse Effekte wie natives Endostatin zeigt.

Zurzeit werden Phase-I-Studien mit rh-Endostatin an Patienten mit fortgeschrittenen soliden Tumoren durchgeführt. Bisher sind Patienten mit rh-Endostatin in drei verschiedenen Phase-I-Studien behandelt worden. Es gab keine SAEs (Serious adverse events) und keine dosislimitierende Toxizität bis zu Dosen von 600 mg/m2/d i.v. Fünf von zwölf Patienten, die zwischen 4-12 Monaten eine rh-Endostatin-Therapie bekamen, zeigten während mindestens 4 Monate einen stabilen Krankheitsverlauf [Zogakis TG 2001].

Angiostatin

Angiostatin in Form von mit Liposomen ummantelten, für die cDNA für Angiostatin codierenden Plasmiden, zeigte in Nacktmäusen, denen zuvor Melanomzellen xenotransplantiert worden waren, eine 50-90%ige Wachstumsinhibition der Melanome [Rodolfo M 2001].

Das Überleben von Mäusen mit leptomeningealen Melanommetastasen konnte durch Angiostatin ebenfalls verlängert werden [Reijneveld JC 2003].

4.9.3 Substanzen, die Angiogenesefaktoren blockieren

VEGF gilt als einer der wichtigsten proangiogenetischen Faktoren unter normalen und pathologischen Bedingungen und soll deswegen hier exemplarisch diskutiert werden [Detmar M 2000]. Es handelt sich um ein heparinbindenes, homodimerisches Glykoprotein, von dem mindestens vier Isoformen als Produkt alternativen Splicings existieren, welche aus 121 bzw. 165, 189 oder 201 Aminosäuren bestehen. VEGF-121 ist die vorherrschende Isoform im Melanom. VEGF bindet an zwei Typ-III-Tyrosinkinase-Rezeptoren, VEGFR-1 (= Flt-1) und VEGFR-2 (= Flk-1) sowie an Neuropilin-Rezeptoren. Diese werden hauptsächlich auf Gefäßendothelzellen exprimiert, sind jedoch auch auf Melanomzellen selbst zu finden, ebenso wie Rezeptoren für bFGF und IL-8 [Rofstad EK 2000]. Wahrscheinlich fungieren VEGF, bFGF und IL-8 hier als autokrine und parakrine Wachstumsfaktoren [Rofstad EK 2000] [Lacal PM 2000], zumal deren Inhibition mit neutralisierenden Antikörpern das Wachstum von Melanommetastasen zu hemmen vermag [Rofstad EK 2000]. Zudem kann VEGF die Ausschüttung von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) in Endothelzellen induzieren [Zucker S 1998]. Melanozyten zeigen keine VEGF-Expression, im Gegensatz zu Melanomzellen. VEGF wird in 32% der primären Melanome exprimiert, in Metastasen jedoch in einem größeren Prozentsatz. Melanomzelllinien, die experimentelle Tumoren mit niedriger Metastasierungsaktivität entwickeln, zeigen niedrigere Expressionslevel von VEGF-A, verglichen mit hochmetastatischen Tumor-Xenotransplantaten [Lacal PM 2000]. Überexpression von VEGF-A in SK-Mel-2-Melanomen, welche normalerweise niedrige Level von VEGF exprimieren, führt zu erhöhter Angiogenese, verstärktem Tumorwachstum und vermehrter Metastasierung in vivo. VEGF erhöht außerdem die Invasivität von Tumorzellen. So ist die vertikale und horizontale Wachstumsphase in Melanomen mit einer erhöhten VEGF-Expression und -Akkumulation im Tumorstroma assoziiert. Diese Ergebnisse machten VEGF und dessen Rezeptoren zu einem Hauptangriffsziel für verschiedenste antiangiogenetische Therapien.

Monoklonale VEGF-Antikörper

Bevacizumab ist der bisher erfolgreichste monoklonale VEGF-Antikörper [Luttun A 2004]. Auf SCID-Mäuse xenotransplantierte humane Glioblastome und Kolonadenokarzinome, nicht jedoch P-Mel-Melanome, zeigten in vivo unter Bevacizumab verringerte Gefäßdurchmesser sowie eine reduzierte Gefäßpermeabilität. Als wichtigste Nebenwirkungen gelten ein erhöhtes Thromboserisiko, pulmonale Hämorrhagien (nur bei Patienten mit pulmonalen Tumoren beobachtet), arterielle Hypertonie und selten leichte Proteinurie [Gray R 2003] [Hinoda Y 2004]. Bevacizumab wurde in Kombination mit anderen Chemotherapeutika bereits erfolgreich bei Patienten mit Kolonkarzinom [Fernando NH 2003] [Saltz LB 2000], Mammakarzinom [Miller KD 2002], Nierenkarzinom [Yang JC 2003] sowie mit NSCLC [Johnson DH 2004] eingesetzt. Im Rahmen der Behandlung von 6 Patienten mit nicht metastasiertem Rektumkarzinom zeigte Bevacizumab signifikante Reduktionen der intratumoralen Blutperfusion, des intratumoralen Blutvolumens und der Mikrogefäßdichte (MVD) sowie Hinweise auf eine normalisierende Wirkung auf die intratumorale Blutgefäßarchitektur [Willett CG 2004]. Die erste erfolgreiche Phase-III-Studie zum metastasierenden Kolonkarzinom wurde 2003 von McCarthy et al. abgeschlossen [Willett CG 2004].

Synthetische VEGF-Rezeptor-Inhibitoren

SU-5416 und SU-6668 verhindern über die Blockade der ATP-Bindungsstelle der Rezeptor-Tyrosinkinasen, dass die VEGF-Rezeptoren phosphoryliert werden und eine intrazelluläre Signaltransduktion stattfinden kann [Mendel DB 2000]. In vitro werden VEGFR-2 und PDGFR (Platelet derived growth factor receptor) von SU-5416 inhibiert, der Rezeptor für FGF (Fibroblast growth factor) hingegen kaum. Weitere in vitro-Studien zeigen, dass SU-5416 die Proliferation von HUVEC (humanen Umbilikalvenen-Endothelzellen) inhibiert, wenn man diese zuvor durch VEGF, nicht jedoch durch FGF stimuliert hat. In vitro zeigt SU-5416 keinen direkten Effekt auf Überleben, Proliferationsrate und Apoptoseverhalten von neurogenen Sarkomzellen. Das Wachstum und die Tumorvaskulisierung von Xenotransplantaten neurogener Sarkome auf NOD/SCID-Mäusen war jedoch nach i.p.-Behandlung der Tiere mit SU-5416 signifikant verringert. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die intraperitoneale Injektion von SU-5416 das Wachstum von verschiedenen subkutan in BALB/c-Mäuse implantierten humanen Tumorzelllinien hemmt, darunter von A375-Melanomzellen, deren Wachstum am 38. Tag nach Injektion um 85% gegenüber der Kontrolle inhibiert worden war.

In klinischen Phase-I-Studien wurde gezeigt, dass SU-5416 von Patienten in der Regel gut toleriert wird. Zeichen geringer Toxizität wie Kopfschmerzen oder Übelkeit wurden beobachtet, jedoch keine Myelosuppression [Mendel DB 2000]. Die klinische Wirksamkeit wurde in Phase-I-Studien für AIDS-assoziierte Kaposi-Sarkome (n = 20) [Mendel DB 2000] belegt. Bei der Behandlung von Patienten mit Nierenzellkarzinomen und Weichteilsarkomen zeigte sich eine nur geringfügige klinische Wirksamkeit; bei Melanompatienten war SU-5416 nicht wirksam [Kuenen BC 2003].

SU-6668 ist ein Abkömmling von SU-5416, der sich durch eine stärkere Inhibition der PDGFR-Autophosphorylierung, eine schwächere Inhibition der Transphosphorylierung von VEGFR-flk-1 und FGFR, sowie durch eine höhere orale Bioverfügbarkeit auszeichnet [Laird AD 2000]. SU-6668 inhibiert die VEGF- und FGF-induzierte Mitogenese von HUVECs in vitro [Laird AD 2000]. In Nacktmäusen induzierte SU-6668 eine dosisabhängige Wachstumshemmung von Xenotransplantaten diverser Tumoren humanen Ursprungs, einschließlich des Melanoms [Laird AD 2000]. In BALB/c-Mäusen, denen die Substanz täglich intraperitoneal verabreicht wurde, kam es zu einer Reduktion der Metastasen kolorektaler Tumoren um 55,3%. Zum Melanom sind noch keine klinischen Studien veröffentlicht.

Ribozyme gegen VEGFR-mRNA

Ribozyme sind Enzyme, die sequenzspezifisch an RNA-Moleküle binden und diese spalten, mit der Folge verminderter Proteinexpression. Durch Modifikationen sind sie vor dem Abbau durch Nukleasen geschützt und bleiben somit in vivo aktiv. Eine Reihe von Ribozymen, die auf verschiedene Domänen der Flt-1- und Flk-1-mRNA des Menschen, der Maus und der Ratte abzielten, wurden in vitro auf ihre Fähigkeit getestet, die Proliferation von humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMVEC-d) zu inhibieren. Die beiden effektivsten Ribozyme, eins gegen den mRNA-Ort 4229 des Flt-1-Rezeptors und eins gegen den mRNA-Ort 762 des Flk-1-Rezeptors, inhibierten auch in vivo VEGF-induzierte Angiogenese der Rattenkornea und, als kontinuierliche i.v.-Behandlung, auch das subkutane Wachstum von Lewis-Bronchialkarzinomen in Nacktmäusen [Pavco PA 2000]. Bei der Behandlung pulmonaler Lewis-Lungenkarzinommetastasen in Nacktmäusen zeigte sich das Anti-Flt-1-Ribozym effektiver als das Anti-Flk-1-Ribozym. Das Anti-Flt-1-Ribozym inhibierte ebenfalls signifikant das Wachstum humaner Kolonkarzinommetastasen in Nacktmäusen [Pavco PA 2000]. Daraufhin wurde das Anti-Flt-1-Ribozym (Angiozyme) in klinischen Studien weiter evaluiert. In Mäusen konnten sowohl via i.p. als auch via s.c. Applikation schnelle und extensive Absorption mit maximalen Plasmakonzentrationen nach 30 min. erreicht werden. Cynomolgus-Affen tolerierten auch i.v. und s.c. verabreichte Einzeldosen von 100 mg/kg gut [Sandberg JA 2000]. Bei s.c. Applikation zeigte sich dabei eine verlängerte Absorptions-und Verteilungsphase von mindestens 9 Stunden [Sandberg JA 2000]. Auch in einer Phase-I-Studie mit freiwilligen Probanden und Krebspatienten zeigte sich das Anti-Flt-1-Ribozym bei Dosen bis zu 300 mg/m2 gut verträglich [Parker V 2000]. Die Bioverfügbarkeit bei s.c. Applikation wurde auf 74-90% geschätzt [Parker V 2000]. Derzeit werden einige Phase-II-Studien an Patienten mit fortgeschrittenen Malignomen durchgeführt.

DNA-Vakzine gegen VEGFR-2

DNA-Vakzine unterscheiden sich von konventionellen Vakzinen dadurch, dass das Zielantigen der Vakzinierung erst intrazellulär durch Transkription aus dem verabreichten DNA-Stück hergestellt wird. Dieses wird mittels eines Vektors (z.B. Adenovirus, Salmonella typhimurium) in die gewünschten Zellen befördert (z.B. in Enterozyten bei enoraler Vakzinierung) und dort auf der Zelloberfläche als Antigen präsentiert. Dieser Weg der Immunisierung ist von Vorteil, da die zelluläre Immunität, die oft durch die Tumorerkrankung geschwächt ist, weniger benötigt wird als bei der konventionellen Vakzinierung und die Tumorantigene oft wenig immunogen sind. Für Mäuse mit subkutan implantierten Melanomen, Kolonkarzinomen oder NSCLC konnte gezeigt werden, dass die orale Vakzinierung gegen den VEGF-Rezeptor-2 (mit pcDNA3.1-FLK-1 und S. typhimurium als Vektor) zu einer deutlichen Tumorwachstumsinhibition führten, die im Falle des Kolonkarzinoms über 10 Monate nach der letzten Injektion anhielt [Niethammer AG 2002]. Im Gegensatz dazu fand sich in der Kontrollgruppe, der nur der leere Vektor verabreicht worden war, eine rasche Tumorprogression. Die Wirkung wird über CD8+-T-Lymphozyten vermittelt [Niethammer AG 2002]. Klinische Versuche zu dieser speziellen DNA-Vakzine stehen noch aus.

Carboxyamidotriazol

Carboxyamidotriazol inhibiert die Kalziummediierte Signaltransduktion und hemmt auf diese Weise die durch VEGF-A hervorgerufene Endothelzellproliferation. Bei Melanompatienten führte Carboxyamidotriazol zu einer Stabilisierung des klinischen Bildes.

Plättchenfaktor-4

PF-4 inhibiert Endothelzellmigration und -proliferation via Inhibition von bFGF und VEGF und inhibiert das Tumorwachstum und Metastasierung von xenotransplantierten Melanomen und Kolonkarzinomen in Mäusen. Klinische Versuche stehen noch aus.

4.9.4 Inhibitoren der Matrix- Metalloproteinasen

MMPs sind eine Gruppe zinkabhängiger Proteine, welche Komponenten der Basalmembran und der extrazellulären Matrix (ECM) degradieren können. Ihre Synthese und Sekretion verläuft in Form von inaktiven Vorstufen (pro-MMPs), die erst durch die Aktivität anderer Proteinasen aktiviert werden müssen. Man unterteilt MMPs in fünf Gruppen: Kollagenasen (MMP-2, und -9), Gelantinasen (MMP-1, -8 und -13), Stromolysine (MMP-3, -10 und -13), Membran-Typ-MMPs (MMP-14 bis -17) und "Andere" (MMP -12, -19 und -20).

MMPs spielen eine wichtige Rolle in der Metastasierungsfähigkeit von Tumoren. Die Degradierung der ECM durch MMPs ermöglicht die Tumorzellinvasion in Blut- und Lymphgefäße sowie andere Gewebe. In einigen Studien wurde ein Zusammenhang zwischen Tumoraggressivität und hoher MMP-Expression gezeigt. Die Tumorangiogenese ist ebenfalls abhängig von der Degradierung der Basalmembran und der Endothelzellmigration. MMP-2 und MMP-9 scheinen hierbei eine wichtige Rolle zu spielen. Nach Transplantation einer murinen Melanomzelllinie auf MMP-2-Knock-out-Mäuse wurde eine verringerte Angiogenese beobachtet [Itoh T 1998]. MMP-9-Knock-out-Mäuse zeigten Knochenwachstumsdefekte, für die man eine verzögerte Angiogenese verantwortlich macht [Vu TH 1998].

Natürlich existierende Matrix-Metalloproteinasen-Inhibitoren

Natürlich existierende MMP-Inhibitoren wurden unter den Namen "tissue inhibitors of metalloproteinases-1, -2, -3 und -4" beschrieben (TIMP-1 bis -4). Sie inaktivieren MMPs, indem sie nichtkovalent an deren katalytische Domäne binden. TIMP-1 inhibiert die bFGF-induzierte Endothelzellproliferation. TIMP-2 inhibiert die bFGF-stimulierte humane mikrovaskuläre Endothelzellen in vitro. Des Weiteren fand sich in TIMP-2-transfizierten B16F10-Melanomzellen eine reduzierte Angiogenese. TIMP-4-transfizierte Tumoren zeigen eine deutlich geringere Mikrogefäßdichte als die Kontrollgruppe.

Synthetische Matrix-Metalloproteinasen-Inhibitoren

Synthetische MMP-Inhibitoren (MMPIs) sind dahingehend den natürlichen MMPIs ähnlich, dass sie die enzymatische Aktivität der MMPs hemmen, indem sie selektiv und kompetetiv an die aktive Zinkbindungsstelle binden [Nelson AR 2000]. MMPIs wirken vermutlich auch über die Hemmung von Endostatin antiangiogenetisch [Kruger A 2001].

Einer der ersten synthetischen MMPIs war Batimastat, ein Hydroxamsäurederivat, das strukturell auf Kollagen basiert, einem natürlichen Substrat von MMPs. Batimastat zeigt antineoplastische und antiangiogenetische Aktivität in vitro und in vivo. Batimastat inhibiert die Angiogenese von B16F1-Melanom-Lebermetastasen. Überraschend stellte sich bei der Behandlung von T-Zell-Lymphomen heraus, dass Batimastat die Bildung von Lebermetastasen begünstigt [Kruger A 2001]. Batimastat zeigte in Phase-I-Studien auch in hohen Dosierungen kaum systemische Toxizität, konnte jedoch nur intrapleural verabreicht werden und wurde daher bald zugunsten von oral bioverfügbaren MMPIs verlassen.

Marimastat (BB-2516), der erste MMPI aus dieser Gruppe, inhibiert MMP-1, -2, -7 und -9. Dosen zwischen 50-200 mg p.o., in 12-stündigem Abstand verabreicht, wurden generell gut toleriert. Die wichtigsten Nebenwirkungen waren dosisabhängig und nach Absetzen reversibel (z.B. muskuloskeletale Schmerzen und Müdigkeit). Phase-II-Studien an Patienten mit fortgeschrittenem Pankreaskarzinom [Bramhall SR 2001] und an 369 Patienten mit fortgeschrittenem Magenkarzinom [Nelson AR 2000] zeigten keine signifikanten Unterschiede in der Überlebenszeit zwischen Marimastat- und Kontrollgruppe. In einer Phase-II-Studie an 28 Patienten mit metastasierendem Melanom zeigte Marimastat ebenfalls nur mäßige Wirksamkeit, mit partiellem Ansprechen bei 2 Patienten und stabilem Krankheitsverlauf bei 5 Patienten [Quirt I 2002].

BAY12-9566 ist ein potenter Inhibitor von MMP-2, -3 und -9. Antitumoraktivität konnte für das murine B16-Melanom, das Kolonkarzinom und das Lewis-Bronchialkarzinom nachgewiesen werden [Zogakis TG 2001]. In klinischen Studien konnte diese Wirksamkeit jedoch nicht bestätigt werden [Yip D 1999] [Zogakis TG 2001].

Prinomastat (AG-3340) ist ein Inhibitor von MMP-2, -3, -9, -13 und -14, der das Xenotransplantatwachstum von Kolontumoren, Gliomen und NSCLCs hemmt. Phase-I-Studien zeigten minimale Nebenwirkungen, v.a. Arthralgien und leichte andere Schmerzzustände. In Dosierungen von 2x 5 - 2x 100 mg/d wurde Prinomastat im Rahmen einer Phase-I-Studie Patienten mit fortgeschrittenen Lungen-, Prostata-, Nieren- und kolorektalen Karzinomen sowie Sarkomen und Melanomen verabreicht [Zogakis TG 2001]. Es kam bei 25 Patienten zu einem 4-10 Monate dauernden stabilen Krankheitsverlauf.

Metastat (COL-3)ist ein chemisch modifiziertes Tetrazyklin (CMT) ohne antimikrobielle Aktivität, das über die Inhibition von Trypsinogen-2-mRNA-Expression die Aktivierung von pro-MMPs hemmt sowie die MMP mRNA herunterreguliert und die katalytische Aktivität von MMPs hemmt [Lukkonen A 2000]. Metastat hat einen direkten inhibitorischen Effekt auf die Membran-Typ-1-MMP-Expression und auf die Aktivität von pro-MMP-2 in Osteosarkomzellen [Lee HM 2001]. In einer Phase-I-Studie war die dosislimitierende Toxizität bei 69% der Patienten Photosensitivität. Die maximal tolerierte Dosis lag bei 70 mg/m2/d [Zogakis TG 2001].

4.9.5 Substanzen mit multiplen/unbekannten Wirkungsmechanismen

Thalidomid

Thalidomid ist in den klinischen Gebrauch zurückgekehrt, nachdem es in den 60er-Jahren wegen Teratogenität vom Markt genommen worden war. Neugeborene von Müttern, die Thalidomid als Sedativum genommen hatten, wurden oft mit Dysmelie geboren. D'Amato et al. postulierten 1994, dass dieser Effekt von Thalidomid auf eine Inhibition des Blutgefäßwachstums in den sich entwickelnden Extremitäten zurückginge und demonstrierten zum ersten Mal die antiangiogenetischen Eigenschaften von Thalidomid in vivo, indem sie aufzeigten, dass die orale Gabe der Substanz bei Kaninchen zu einer Inhibition der bFGF-induzierten Vaskularisierung im Kornealbereich führt. Der genaue antiangiogentische Mechanismus von Thalidomid ist jedoch noch nicht vollständig bekannt. Thalidomid inhibiert die Produktion von TNF-α stark. Thalidomid stimuliert humane T-Lymphozyten, was zur Freisetzung verschiedener Zytokine führte. Wie diese verschiedenen immunmodulatorischen Wirkungen die Angiogenese hemmen, ist noch unbekannt. Thalidomid reduziert die Expression der β-Untereinheiten von Integrinen, besonders die Expression von β2- und β3-Untereinheiten, welche von Leukozyten produziert werden. Thalidomid inhibiert Endothelzellen über einen im Detail unbekannten Mechanismus [Hwu WJ 2000]. Endothelzellen binden an das αvβ3-Integrin, um im Rahmen der Angiogenese mit der ECM zu adherieren und durch sie hindurch zu migrieren.

Thalidomid inhibiert experimentelles Melanomwachstum effizient [Hwu WJ 2000]. Der Applikationsmodus von Thalidomid scheint eine wichtige Rolle bei der Inhibition des Tumorwachstums zu spielen. So konnte bei Mäusen nach Xenotransplantation eines humanen Ösophaguskarzinoms eine signifikante Reduktion der Tumorgröße und der Anzahl von Mikrogefäßen nach intraperitonealer, nicht aber nach peroraler Applikation festgestellt werden. Bauer et al. konnten zeigen, dass ein Metabolit von Thalidomid in Menschen und Kaninchen für die Antitumor- und antiangiogenetische Aktivität der Substanz notwendig ist und dass die experimentelle Angiogenese durch Kombination mit IFN-α2b in vivo potenziert wird [Bauer JA 2003].

Bei Patienten mit AIDS-assoziierten Kaposi-Sarkomen lag die maximal tolerierte Dosis im Rahmen einer Phase-I-Studie bei 600 mg/d. Nebenwirkungen sind Teratogenität (s.o.), tiefe Beinvenenthrombosen (5-30%), Ödeme (5-20%), periphere Neuropathien (10-50%), Somnolenz (>50%), Obstipation (>50%), Exantheme (25%), Xerostomie (10%), Juckreiz (20-50%), Fieber, Kopfschmerzen, Depressionen (5-20%), Leberfunktionsstörungen, Hypothyreoidismus [Eleutherakis-Papaiakovou V 2004] sowie tiefe Beinvenenthrombosen [Laffitte E 2004]. In einer Phase-I-Studie zum Thalidomid-Analogon CC-5013 zeigte von 20 Melanompatienten im Stadium IV ein Patient eine partielle Remission und 5 Patienten einen stabilen Verlauf. Bei einer ansteigenden Dosierung auf 50 mg/d lagen die Nebenwirkungen gemäß CTC (Common Toxicity Criteria) zu 87% im Bereich von Grad I und II [Bartlett JB 2004]. In einer Phase-II-Studie, in der Thalidomid-Dosen von max. 800 mg verabreicht wurden, zeigten 7 von 20 Melanompatienten (35%) einen stabilen Krankheitsverlauf [Pawlak WZ 2004]. Die Kombination von Temozolomid und Thalidomid zeigte in einer Phase-II-Studie bei 38 Melanompatienten (37 Patienten in Stadium IV, 1 Patienten in Stadium IIIc) eine Ansprechrate von 32%. In einem Fall kam es zu einer anhaltenden Komplettremission und bei 11 Patienten zu einem partiellen Ansprechen, von denen bei 5 Patienten eine Reduktion der Tumormasse um >90% und nach anschließender Operation eine Komplettremission erreicht werden konnte [Hwu WJ 2003]. Nebenwirkungen waren in 37% der Patienten eine drittgradige Lymphopenie, neben anderen hämatologischen Veränderungen, sowie Exantheme, gastrointestinale Beschwerden, Müdigkeit, Schwindel, Kopfschmerzen und Infektionsneigung [Hwu WJ 2003]. CC5013 wird zurzeit in Phase-III-Studien bei Patienten mit metastasierendem Melanom und multiplem Myelom untersucht.

Suramin

Suramin ist ein polysulfonierter Naphthylharnstoff, der ursprünglich in den 20er-Jahren gegen Trypanosomiasis und Onchozerkose eingesetzt wurde. Suramin inhibiert eine Reihe von Wachstumsfaktoren unspezifisch und interferiert mit dem Glykosaminoglykan-Abbau, der mit Zellproliferation vergesellschaftet ist. Suramin und -Analoga können Heparanase inhibieren, was auch spezifisch für die Melanom-Heparanase belegt ist. Heparanase spaltet u.a. Heparansulfat-Proteoglykane der ECM (ECM-HSPG), welche direkt in die Angiogenese involviert sind, da sie ein Reservoir für bFGF, VEGF und andere proangiogenetische Faktoren darstellen. An einer humanen Melanom-Hirnmetastasen-Zelllinie (70 W) konnte gezeigt werden, dass verschiedene Suramin-Analoga die Heparanase sowie die Heparanase-bedingte Zersetzung der subendothelialen ECM und die Angiogenese hemmen [Marchetti D 2003]. Zusätzlich kann Suramin, wie auch Protaminsulfat, rezeptorgebundenes VEGF vom VEGF-Rezeptor-1 entfernen. In einem Mausmodell wurde in der Behandlung von experimentellen Melanomen eine erhöhte antitumorale Wirksamkeit durch die Kombination von Suramin mit einem chimären Toxin gegen bFGF im Vergleich zu Suramin als alleiniges Agens gezeigt [Marchetti D 2003].

Der klinische Gebrauch von Suramin wird durch dessen Toxizität limitiert (anaphylaktische Reaktionen, Neutropenie, Infektionen, Koagulopathien, Nierenversagen, Hepatitis). Eine Reihe von Suramin-Analoga zeigen weniger Toxizität und antiangiogenetische Aktivität auf Tumorzellen in vitro und angiostatische Aktivität auf embryonale Zellen in vivo.

IL-12

IL-12 ist ein komplexes Zytokin mit antineoplastischen und antiangiogenetischen Eigenschaften in vivo. IL-12 kann über eine Aktivierung von T- und NK-Zellen zur zellulären Tumorabwehr beitragen. Es induziert die Produktion von IFN-γ, was die zelluläre Immunantwort zusätzlich stimuliert. IFN-γ führt in vivo zu vermehrter Produktion von IP-10 (induzierbares Protein-10), das inhibitorisch auf Tumorgefäße wirkt. IP-10 wirkt nicht direkt auf die Endothelzellproliferation und -Migration, sondern reguliert bFGF herunter und interferiert über einen noch nicht im Detail geklärten Mechanismus mit der Ausbildung von röhrenartigen Strukturen durch Endothelzellen.

IL-12 inhibiert die korneale Neovaskulisierung in vivo, nicht jedoch die Endothelzellproliferation in vitro. Die antiangiogenetische Aktivität von IL-12 in vivo konnte in derselben Studie durch Beigabe von neutralisierendem Antikörper gegen IFN-γ unterbunden werden. Ein neutralisierender Antikörper gegen IP-10 verringerte den antiangiogenetischen Effekt von IL-12 in vivo, jedoch weniger als ein neutralisierender Antikörper gegen IFN-γ im selben Versuch, was nahe legt, dass IFN-γ über mehr als nur IP-10 antiangiogenetisch wirkt. In athymischen Mäusen konnte ein neutralisierender Antikörper gegen NK-Zellen den antiangiogenetischen Effekt von IL-12 signifikant reduzieren.

IL-12 inhibiert das Tumorwachstum verschiedener Tumoren in vivo. In Mäusen mit s.c. implantierten B16F10-Melanomen führten intraperitoneale Injektionen von IL-12 zu einer Inhibition des Tumorwachstums. Boggio et al. zeigten bei mit IL-12 behandelten Mäusen eine signifikante Verringerung der Mikrogefäßanzahl in Mammakarzinomen. In Kombination mit Batimastat oder IFN-α wurde jeweils eine höhere Wirksamkeit als mit einer der Einzelsubstanzen bei B16F10-Melanomen in Mäusen erreicht [Dabrowska A 2001].

Phase-I-Studien ergaben eine empfohlene Dosierung für IL-12 von 500 ng/kg [Alatrash G 2004]. Als Nebenwirkungen wurden eine Verschlechterung des Allgemeinzustands, Fieber, Erbrechen, Depression, pulmonale Nebenwirkungen, Hepatotoxizität und Leukopenien beschrieben. In dieser Studie erfuhr ein Patient von 20 eine komplette Remission und in einer anderen Studie ein Patient von 50. In einer Studie an 12 Patienten mit fortgeschrittenen malignen Tumoren kam es in je einem Fall zu komplettem (Melanom) und partiellem (Nierenzellkarzinom) Ansprechen. Bei einer Studie, in der IL-12 und IFN-α2b kombiniert wurden, zeigte einer von sieben Melanompatienten ein partielles Ansprechen [Alatrash G 2004]. Bemerkenswerte Resultate konnten mit intratumoraler Verabreichung von für IL-12 kodierender Plasmid-DNA mittels Elektroporation erzielt werden [Lucas ML 2003]. 80% der behandelten Mäuse mit B16.F10-Melanomen wurden für >100 d tumorfrei ("Heilung") und resistent gegen eine erneute Exposition mit B16.F10-Melanomzellen. In einem zusätzlichen Versuch konnte auch eine geringere Metastasierungstendenz von kontralateral zum behandelten Tumor implantierten Tumorzellen unter dieser Therapie gezeigt werden. Intratumorale Injektion von für IL-12 kodierender Plasmid-DNA zeigte in Mäusen und Pferden melanomsupprimierende und antimetastatische Wirkung [Heinzerling LM 2002] [Heinzerling LM 2001]; in einer darauf folgenden Studie von Heinzerling et al. an 9 Patienten mit metastasierendem Melanom zeigten sich in einem Fall eine Komplettremission einer großen Läsion, bei 3 Patienten eine dramatische Tumorregression sowie einige stabile Krankheitsverläufe. Bei 8 Patienten traten lokale Reaktionen an der injizierten Metastase bzw. Reaktionen in lokalen Lymphknoten auf. In 4 Fällen zeigte sich ein Ansprechen von anderen, nicht injizierten Fernmetastasen [Heinzerling LM 2005].

Thrombospondin-1

Thrombospondin-1 (TSP-1) und TSP-2 inhibieren die Angiogenese und das Wachstum von Melanom-Xenotransplantaten in Mäusen [Streit M 2002]. TSP inhibiert das Endothelzellwachstum, die Migration, die Röhrenbildung durch Endothelzellen und kann Apoptose induzieren.

Interferon-α

Interferon-α (IFN-α) inhibiert die Produktion von VEGF und von bFGF und zeigt antiangiogenetische Aktivität beim Melanom [Lindner DJ 2002], Hämangiom, Nierenzellkarzinom [Motzer RJ 2002] und beim Kaposi-Sarkom [Krown SE 2001]. In Kombination mit Thalidomid [Bauer JA 2003] und cis-Retinsäure konnte eine erhöhte Wirksamkeit erzielt werden. Ein vorteilhafter Effekt konnte bei Patienten mit operablen Hochrisiko-Melanomen gezeigt werden [Kirkwood JM 2000]. In Kombination mit Temozolomid zeigten von 40 Melanompatienten 2 eine komplette Remission, 5 ein partielles Ansprechen und 13 einen stabilen Verlauf über eine Dauer von 2,6 Monaten [Ridolfi R 2004].

Bei ONKODIN publiziert in Kooperation mit "Deutscher Ärzte-Verlag"; Publikation als Buch: Deutscher Ärzte-Verlag  Deutscher Ärzte-Verlag
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