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Digitale Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) nach Standardisierung durch den internationalen Maßstab für die ABL1-, BCR- und GUS-Gene zur Erfassung der tiefen molekularen Antwort (MR) bei Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie

Titel des Originals:

International Scale (IS)-Standardized BCR-ABL1 Digital Polymerase Chain Reaction (dPCR) Assays Using ABL1, BCR, and GUS Control Genes for Measuring Deep Molecular Response (MR) in Chronic Myeloid Leukemia (CML)

Abstract-Nr.:

136

Jahr:

2015

Original im Internet:

Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2015 126: Abstract 136

Autor/en:

Alice Huang, Jennifer Salcius, MBA, MS*, Connie Wong, PhD*, Stephane Wong and Sha-Sha Wang, PhD*

Institution/en:

Novartis Companion Diagnostics, Cambridge, MA

Zusammenfassung des Berichts

Die digitale PCR scheint im Vergleich zur quantitativen Real-Time-PCR (qPCR) sensitivere und robustere Ergebnisse zu erbringen.

Bericht über die Inhalte der Studie

Begründung, Rationale

Die digitale PCR bietet sich an zur quantitativen Bestimmung der BCR/ABL1-Transkripte aus dem Knochenmark von CML-Patienten unter Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren der zweiten Generation, weil sie eine höhere Sensitivität und Präzision aufweist als die herkömmliche quantitative Realtime-PCR sowie unabhängig von Kalibratoren und dadurch verursachten Fehlern ist. Bislang ist die Validierung der digitalen PCR für die Bestimmung von BCR/ABL mit multiplen Kontrollgenen sowie die Standardisierung entsprechend dem WHO-Maßstab (International Scale, IS) nicht berichtet worden.

Fragestellung der Studie

In dieser Studie wird die Entwicklung, Validierung und IS-Standardisierung einer sensitiven dPCR für BCR/ABL1 mittels 3 verschiedener Kontrollgene beschrieben. Ebenso wird die Vergleichbarkeit dreier verschiedener PCR-Plattformen (Bio-Rad QX200, RainDance RainDrop System, und Applied Biosystems QuantStudio3D) getestet.

Art der Studie

Retrospektive Laboruntersuchung

Behandlung, Protokolle, Durchführung bzw. Methode

  • Drei BCR/ABL1-dPCR-Messverfahren auf der Bio-Rad-Konsole wurden entwickelt unter Verwendung von ABL1, BCR und GUS als Kontrollgene. Alle drei Ansätze wurden entsprechend des Internationalen Standards mittels WHO-Referenzpanel standardisiert. Die drei messtechnischen Ansätze wurden jeweils validiert hinsichtlich Linearität, Präzision, Genauigkeit, Detektions- und Leerwertbegrenzung entsprechend der Industriestandards und Richtlinien des Instituts für Laborstandards (CLSI).
  • Multiple Primerpaare für BCR/ABL1 und ABL1 wurden in den qPCR- sowie den dPCR-Verfahren getestet.
  • Die drei verschiedenen digitalen PCR-Plattformen (Bio-Rad QX200, RainDance RainDrop System, und Applied Biosystems QuantStudio3D) wurden miteinander verglichen.
  • Die Sensitivität der digitalen PCR für BCR/ABL1 wurde aus zwei verschiedenen Blutröhrchen PAXgene und K2EDTA verglichen, um die tiefe molekulare Antwort bei CML-Patienten zu erfassen.

Ergebnisse, Toxizität

  • Die Angleichung des BCR/ABL1-dPCR-Ansatzes an den WHO-IS-Standard ergab einen Umrechnungsfaktor für ABL1 von 0,93, für BCR von 1,85 sowie für GUS von 1,28. Das molekulare Ansprechen aus Blutproben der CML-Patienten mittels des WHO-IS-kalibrierten dPCR-Ansatzes ergab eine Sensitivität oberhalb von MR4,5, nämlich zwischen MR5,0 und MR5,5. Bei einem Assay unter Verwendung multipler dPCR-Ansätze, welche Tausende bis Millionen von einzelnen Reaktionen beinhaltet, konnte die jeweilige Sensitivität und Präzision deutlich erhöht werden.
  • Die Auswertung von 10 verschiedenen BCR/ABL1-Primerpaaren auf der Bio-Rad-Plattform ergab Differenzen von weniger als einem Faktor 2 verglichen mit der qPCR-Plattform auf der sich ein 16- bis 32-facher Unterschied ergab. Dies ist erklärlich, weil die dPCR als Endpunkt-PCR-Reaktion besteht.
  • Im Vergleich der verschiedenen dPCR-Plattformen ergab sich ein Unterschied von weniger als 1:2. Dies wurde getestet bei einem selektionierten Primerset bei einer gestellten BCR/ABL1-Verdünnung von 10% bis 0,0032% nach IS. Dieses Ergebnis legt eine Robustheit der dPCR nahe, unabhängig welche PCR-Plattform dafür gewählt wird.
  • Im Vergleich der zwei verschiedenen Blutröhrchensysteme K2EDTA und PAXgene ergibt sich ein Korrelationskoeffizient hinsichtlich des gemessenen MR-Wertes von >0,99. Daraus ergibt sich, dass beide Blutröhrchen-Matrices für die dPCR keine Unterschiede aufweisen, somit gleichermaßen verwendet werden können.

Schlussfolgerung der Autoren aus der Publikation

Im Vergleich zur qPCR erscheint die dPCR zum Nachweis von BCR/ABL1-Transkripten sowie Verhältnissen zu Kontrollgenen mit einer erhöhten Sensitivität mit Ergebnissen zwischen MR5,0 und MR5,5 und Präzision ausgestattet zu sein. Ebenso erscheinen die Ergebnisse im Gegensatz zur qPCR unabhängig vom gewählten Primerset wie auch von dem gewählten dPCR-Messsystem zu sein. Die Ergebnisse legen nahe, dass die dPCR robuste BCR/ABL1-Quantifizierung auf dem WHO-IS-Standard erlaubt, ohne interne Kalibratorprüfung oder ausgedehnte Optimierung des Versuchsansatzes zu benötigen.

Kommentar / Beurteilung

Diese Präsentation ist ein gewisser Meilenstein hinsichtlich der quantitativen Erfassung von BCR/ABL1-Transkripten. Wünschenswert wäre, dass mittels des dem WHO-IS angepassten Messsystems auch CML-Patienten innerhalb einer klinischen Studie überwacht werden, insbesondere um die erhöhte Sensitivität der erzielten Ergebnisse hinsichtlich ihrer klinischen Relevanz einordnen zu können.


Autor des Berichts:

Prof. Dr. med. Jörg Schubert

Institution:

Medizinische Klinik II, Elblandklinikum Riesa, Weinbergstraße 8, 01589 Riesa

Letzte Änderung:

06.01.2016